▌ 导语
据大通福克斯美国会诊中心（CMAA）了解：当今，肿瘤诊治已迈入个体化及精准医学的时代，这对进一步提高患者治疗的有效性，降低不必要的药物副作用和节约医疗支出都有着深远的意义。那么，我们应该怎样避免二代基因测序（NGS）失效呢?最新相关资讯信息，大通福克斯美国会诊中心（CMAA）将持续为您报道。

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1 ：为什么二代测序(NGS)会失效？
二代测序（NGS）失效有两个原因：
▪ 肿瘤样本不足（数量不足）
▪ 样本的DNA受损（质量不足）

2 ：这种情况多久发生一次？
NGS失效率根据肿瘤的部位和其他影响因素的变化而变化。依据以往的经验，以下三点能够有效降低所有肿瘤部位的NGS失效率：

▪ 近期，美国AL-Kateb等人对1,528例实质性肿瘤进行研究，发现有22.5%的样本显示NGS失效，其中65%的样本由于肿瘤数量不足，29%的样本是由于DNA不充足。

▪ 美国学术中心报道了一项针对500名患者的研究，发现患者NGS失效率为22.2%，失效的原因都与样本的质量和数量不足有关。

▪ 目前在临床实践中，Caris分子图谱的NGS失效率为6-7%。

3 ：什么时候会发生DNA数量不足？
Caris分子图谱从福尔马林固定石蜡包埋的组织中抽取DNA。NGS至少需要50ng的DNA。

由于健康组织的DNA会稀释肿瘤组织DNA的结果，而DNA从较多肿瘤内容物中提取时，诊断的准确性就会提高。

Caris生命科学使用显微解剖技术，在分析前切掉了健康组织。大约50mm²的肿瘤组织足够进行检测。

活检的类型是NGS成功的关键。AL-Kateb等人开展的研究表明，粗针活检和切除活检是最容易成功的（成功率分别为99.3%和96.1%）。而内窥镜活检和细针穿刺活检的成功率分别为63.6%和39.4%。

4 ：什么时候会发生DNA质量不足？
福尔马林固定会引起核酸的交联作用和降解，导致DNA破裂分解。在福尔马林固定石蜡包埋的样本中，分离的DNA质量根据固定条件变化而不同。

组织样本从患者体内取出后尽快放入福尔马林中浸泡一段时间至关重要。另外一点也很重要：组织不能离开固定剂太长时间。固定剂每小时会向样本渗透大约1mm。

因此，如果组织样本厚度低于3-4mm就应该在固定之前进行切割，这样才能确保所有的组织部分在相同的固定条件下完成。

我们建议固定的时间为12-24小时。固定剂溶液除福尔马林和磷酸盐缓冲液外，不能将以前使用的其他成分添加到固定剂中，这样会对NGS起到阻止作用。

为了降低聚合作用，保证维持在4%的浓度值，福尔马林溶液应该在稀释为4%后，在24内使用。

另一个造成NGS失效的原因可能是石蜡内包埋的组织时间过长。我们建议包埋时间不能超过6个月。

5 ：怎样能避免NGS失效？
请参考Caris生命科学提供的“分子图谱组织固定说明”文件，文件中详细介绍了如何固定新鲜组织、渗透固定剂、选择固定剂和样本要求。

有些分子图谱公司将测试时所需组织或DNA较少作为他们的优势。他们的NGS是通过Torrent平台来完成的，而不使用Illumina平台。

但Torrent平台的技术质量低，国际肿瘤医生联盟近期发布了一项提议，不推荐在临床上使用Torrent。NGS成功的关键是组织数量充足和标准的固定流程。

与外科、介入放疗科、病理科医生一起检查组织固定对肿瘤图谱来说非常重要，这样才能够和医生一起实施标准的流程。处理样本时一个细小的改变都很容易引起所有问题。

6 ：如果NGS失效，真正影响患者治疗选择的是什么？
NGS能够传送个体肿瘤中大量的重要信息。但是这些信息中很多都不适合治疗选择。

在Caris分子图谱和其他精准医学的研究中，每5个患者只有1个患者的治疗是根据NGS报告进行的。

与之相比，每5个患者有4个患者的治疗是根据免疫组化和原位杂交生物标志物的综合结果制定的。

对于大多数NGS失效的患者的来说，可以通过Caris分子图谱来选择治疗方案。

7 ：我们还能做什么？
当我们发现因数量问题导致NGS失效时，我们通常会从样本组织中再次抽取DNA并再次进行流程。有时我们也建议再从患者身上取一次样本。

关注流程中的每一个细节至关重要。近期我们发现福尔马林稀释在柠檬酸中会引起样本较高的失效率。

因此，即使NGS在你处理的一两个样本中运行的非常完美，也不意味着病理科不会在流程中出现差错。可能下一个患者就会有NGS失效的问题。

需要告知患者NGS有失效的风险，让他们以正确的心态面对现实中可能出现的问题。

参考文献
1. Al-Kateb H,Nguyen TT,Steger-May K and Pfeifer JD.ldentification of major factors associated with failed clinical molecular oncologytesting performed by next generation sequencing (NGS).Molecular Oncology 2015; 9(9): 1737-1743.
2. Wheler J,Janku F,Naing A et al.Cancer therapy directed by comprehensive genomic profiling: a single center study.Cancer Research2016
3. Maetens M,Brown D,Irrthum A et al (2017).The AURORA pilot study for molecular screen ing of patients with advanced breast cancer-a study of the breastinternational group.npj BreastCancer 3:23.

4. http://www.medinvents.com/?page_id=278

大通福克斯美国会诊中心（CMAA）是一家专注于为中国患者提供美国高端精准医疗咨询和服务的专业机构。自成立至今，已经为许许多多的中国患者提供了这样的服务，不仅让他们体会到了高端的，专业的服务，而且接受了精准的，个体化的治疗。最重要的是，通过中心提供的服务，很多病人获得了满意的，甚至是超越他们期望的治疗效果。

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